汉景帝三年(公元前154年),吴、楚等国反叛。周亚夫以中尉代行太尉的职务,率领军队向东攻打吴、楚。他向景帝请示说:“吴、楚的军队凶悍迅猛,一时难以同他们正面交锋。我希望暂时听任他们进攻梁国不管,而派兵去断绝他们的粮道,这样才可以制服他们。”景帝同意了他的意见。
        周亚夫调集军队到达荥阳后,吴国军队正在进攻梁国,梁国局势危急,请求救援,亚夫却领军队向东北急行军到达昌邑(古县名,治今山东金乡西北),深挖沟高筑垒进行防守。梁国每天派使者请求太尉救援,但亚夫坚守自己有利的形势,不肯前往救援。梁国无奈便上书给景帝,景帝亲自派使臣来命令太尉去救援梁国,亚夫仍然拒不执行皇帝的诏令,坚守营垒不出兵,而派弓高侯韩穨当等人率领轻骑兵断绝吴、楚军队后方的粮道。吴国的军队缺粮,饥饿难忍,多次挑战,周亚夫始终不出来应战。一天夜里,亚夫军中突然受到惊扰,以至于互相攻击,一直闹到太尉的营帐底下。亚夫始终高卧不起,像没事一样。过了一会,营中也就又恢复安定了。后来吴军奔袭汉军营的东南角,亚夫却叫大家戒备西北方向。不久,吴国的精兵果然奔袭西北,但汉军早有防备,无法攻入。吴国军队受饥挨饿,只得引军撤退。亚夫派出精兵追击,大破吴军。吴王刘濞丢掉他的大部队,只带着几千名精壮的亲兵逃去,退守到江南的丹徒县(治今江苏镇江东丹徒镇)。汉军乘胜追击,把敌兵全部俘虏了,又悬赏千斤黄金捉拿吴王。一个多月以后,东越人便斩了吴王的头前来报告。这次平叛,从防守到反攻,总共只用了3个月时间,吴楚叛乱便被彻底平定了。这时,将领们才领会到太尉周亚夫的计策是完全正确的。
        回到京城以后,朝廷正式任命周亚夫为太尉。5年以后升为丞相。景帝很器重他。