建安五年 (公元200年)，孙策去世，孙权统领大事。周瑜带兵前来奔丧，就留在吴县，以中护军身份和长史张昭共同掌管诸事。建安十一年(公元206年)，他统率孙瑜等人讨伐麻屯、保屯，将他们的首领斩首示众，俘虏了一万余人，然后回军防守宫亭。江夏太守黄祖派将领邓龙率兵数千人进入柴桑，周瑜追击，生擒邓龙送到吴县。十三年 (公元208年) 春天，孙权讨伐江夏，周瑜担任前部大督。

这一年九月，曹操进入荆州，刘琮全军投降，曹操得了他的水军，船只、步兵数十万，吴军将士听了都很恐惧。孙权召见下属各官员，询问计策，大家都议论说：“曹操是豺虎一样的人，但他凭借汉朝丞相的身份，挟持天子，征讨四方，动不动以朝廷的名义，如今若抵抗他，事情会更加不顺利。况且将军的有利形式，能够凭借它抵御曹操的，便是长江天险。现在曹操得了荆州，全部占领了那片地方，刘表训练水军，蒙冲斗舰竟要以千的单位计算，曹操全部布置在沿江，又有步兵、水陆齐下，就是长江之险，曹操也已经与我方共有了。而敌我双方实力悬殊，无法相提并论。我等认为最好还是迎纳他。”周瑜说：“不对。曹操虽然名为汉相，实是汉贼。将军有神勇英武的雄才，又依仗父兄的功业，割据江东，土地方圆数千里，士兵精良，物资充足，英雄之士，乐于报效，应当纵横天下，为汉家朝廷铲除奸邪，消灭祸害。况且曹操自己来送死，难道还能去迎接他吗?请允许我为将军筹划此事!如今即使北方已经安定，曹操没有后顾之忧，可以耗费许多时间来争夺疆域，又能和我们在船舰上决出高低吗?现在北方并未安定，加上马超、韩遂还在关西，是曹操的后患。况且他舍鞍马，凭仗舟船，和吴越争夺较量，这本不是中原人的长处。现在又处于大寒时节，军马没有草料，他们驱赶中原士兵远来江湖之间，水土不服，必然发生疾病。这几种情况，是用兵的禁忌，而曹操都冒犯了。将军捉拿曹操，今日正是适合的时机。我请求拨给精兵三万人，进驻夏口，保证为将军击败曹操。”孙权说： “老贼想要废除汉室自立为帝，蓄谋已久，只是顾忌袁绍、袁术、吕布、刘表与我罢了，如今几位英雄已经被消灭，只有我还在，我与老贼，势不两立。您说应当击破他，与我意甚为符合，这是上天把您送给我啊。”

这时刘备被曹操击败，想要带兵南撤过江，和鲁肃在当阳相遇，就共同策划计谋，因而进驻夏口，派诸葛亮来见孙权。孙权就派周瑜和程普等同刘备并力迎击曹操，两军在赤壁相遇。这时曹军士卒已经发生疾病，初次交战，曹军就被击败，退驻江北。周瑜等驻扎在南岸。周瑜部下将领黄盖说：“现在敌众我寡，难以和他们长久相持。但是看曹军的船队，首尾是固定连接着的。可以用火攻来打败他。”于是周瑜调来大型战船数十艘，船中装满柴草，灌上膏油，外面用帷幕盖住，船上立起牙旗，事先用书信报告曹操，假意说要投降。又预备了快艇，连接在大船的后面，依次向前行驶。曹操部队的官兵都伸长脖子观望，指点着说黄盖来投降了。黄盖放开前面的大船，同时点起火来，此时风势猛烈，大火蔓延到岸上的军营。顷刻之间，便火焰冲天，曹军人马被烧死、淹死的不计其数，曹军于是败退，回师保守南郡。刘备和周瑜等人共同追击。曹操留下曹仁等守江陵城，自己径直返回北方了。